一) 原理
免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸(HAuCl
4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下,聚合成為特定大小的金顆粒,并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài),稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負電荷,可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團形成牢固的結(jié)合,由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合,所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。
膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外,還可以與許多其它生物大分子結(jié)合,如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀,如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng),加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性,因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細胞生物學(xué)等領(lǐng)域。
根據(jù)不同的還原劑可以制備大小不同的膠體金顆粒。常用來制備膠體金顆粒的方法如下。
1.枸櫞酸三鈉還原法
(1)10nm膠體金粒的制備:取0.01%HAuCl4水溶液100ml,加入1%枸櫞酸三鈉水溶液3ml,加熱煮沸30min,冷卻至4℃,溶液呈紅色。
(2)15nm膠體金顆粒的制備:取0.01%HAuCl4水溶液100ml,加入1%枸櫞酸三鈉水溶液2ml,加熱煮沸15min~30min,直至顏色變紅。冷卻后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml,混勻即可。
(3)15nm、18nm~20nm、30nm或50nm膠體金顆粒的制備:取0.01%HAuCl4水溶液100ml,加熱煮沸。根據(jù)需要迅速加入1%枸櫞酸三鈉水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml,繼續(xù)煮沸約5min,出現(xiàn)橙紅色。這樣制成的膠體金顆粒則分別為15nm、18~20nm、30nm和50nm。
2.鞣酸—枸櫞酸鈉還原法
A液:1%HAuCl4水溶液1ml加入79ml雙餾水中混勻。
B液:1%枸櫞酸三鈉4ml,1%鞣酸0.7ml,0.1Mol/L K2CO3液0.2ml,混合,加入雙餾水至20ml。
將A液、B液分別加熱至60℃,在電磁攪拌下迅速將B液加入A液中,溶液變藍,繼續(xù)加熱攪拌至溶液變成亮紅色。此法制得的金顆粒的直徑為5nm。如需要制備其它直徑的金顆粒,則按表15-1所列的數(shù)字調(diào)整鞣酸及K2CO3的用量。
表15-1鞣酸—枸櫞酸鈉還原法試劑配制表
金粒直徑 (nm) | A液 | B液 |
1%HAuCl4 | 雙餾水 | 1%枸櫞酸三鈉 | 0.1Mol/L K2CO3 | 1%鞣酸 | 雙餾水 |
5 | 1 | 79 | 4 | 0.20 | 0.70 | 15.10 |
10 | 1 | 79 | 4 | 0.025 | 0.10 | 15.875 |
15 | 1 | 79 | 4 | 0.0025 | 0.01 | 15.9875 |
(1)玻璃器皿必須*清洗,是經(jīng)過硅化處理的玻璃器皿,或用*次配制的膠體金穩(wěn)定的玻璃器皿,再用雙餾水沖洗后使用。否則影響生物大分子與金顆粒結(jié)合和活化后金顆粒的穩(wěn)定性,不能獲得預(yù)期大小的金顆粒。
(2)試劑配制必須保持嚴(yán)格的純凈,所有試劑都必須使用雙餾水或三餾水并去離子后配制,或者在臨用前將配好的試劑經(jīng)超濾或微孔濾膜(0.45?m)過濾,以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質(zhì)。
(3)配制膠體金溶液的pH以中性(pH7.2)較好。
(4)氯金酸的質(zhì)量要求上乘,雜質(zhì)少。是進口的。
(5)氯金酸配成1%水溶液在4℃可保持?jǐn)?shù)月穩(wěn)定,由于氯金酸易潮解,因此在配制時,將整個小包裝一次性溶解。
膠體金對蛋白的吸附主要取決于pH值,在接近蛋白質(zhì)的等電點或偏堿的條件下,二者容易形成牢固的結(jié)合物。如果膠體金的pH值低于蛋白質(zhì)的等電點時,則會聚集而失去結(jié)合能力。除此以外膠體金顆粒的大小、離子強度、蛋白質(zhì)的分子量等都影響膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合。
1.待標(biāo)記蛋白溶液的制備 將待標(biāo)記蛋白預(yù)先對0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析過夜,以除去多余的鹽離子,然后100 000g4℃離心1h,去除聚合物。
2.待標(biāo)膠體金溶液的準(zhǔn)備 以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl調(diào)膠體金液的pH值。標(biāo)記IgG時,調(diào)至9.0;標(biāo)記McAb時,調(diào)至8.2;標(biāo)記親和層析抗體時,調(diào)至7.6;標(biāo)記SPA時,調(diào)至5.9~6.2;標(biāo)記ConA時,調(diào)至8.0;標(biāo)記親和素時,調(diào)至9~10。
由于膠體金溶液可能損壞pH計的電板,因此,在調(diào)節(jié)pH時,采用精密pH試紙測定為宜。
3.膠體金與標(biāo)記蛋白用量之比的確定
(1)根據(jù)待標(biāo)記蛋白的要求,將膠體金調(diào)好pH之后,分裝10管,每管1ml。
(2)將標(biāo)記蛋白(以IgG為例)以0.005Mol/L pH9.0硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為5?g/ml~50?g/ml,分別取1ml,加入上列金膠溶液中,混勻。對照管只加1ml稀釋液。
(3)5min后,在上述各管中加入0.1ml 10%NaCl溶液,混勻后靜置2h,觀察結(jié)果。
(4)結(jié)果觀察,對照管(未加蛋白質(zhì))和加入蛋白質(zhì)的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管,均呈現(xiàn)出由紅變藍的聚沉現(xiàn)象;而加入蛋白量達到或超過zui低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變。以穩(wěn)定1ml膠體金溶液紅色不變的zui低蛋白質(zhì)用量,即為該標(biāo)記蛋白質(zhì)的zui低用量,在實際工作中,可適當(dāng)增加10%~20%。
4.膠體金與蛋白質(zhì)(IgG)的結(jié)合 將膠體金和IgG溶液分別以0.1Mol/L K2CO3調(diào)pH至9.0,電磁攪拌IgG溶液,加入膠體金溶液,繼續(xù)攪拌10min,加入一定量的穩(wěn)定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發(fā)生沉淀。常用穩(wěn)定劑是5%胎牛血清(BSA)和1%聚乙二醇(分子量20KD)。加入的量:5%BSA使溶液終濃度為1%;1%聚乙二醇加至總?cè)芤旱?/10。
5.膠體金標(biāo)記蛋白的純化
(1)超速離心法:根據(jù)膠體金顆粒的大小,標(biāo)記蛋白的種類及穩(wěn)定劑的不同選用不同的離心速度和離心時間。
用BSA做穩(wěn)定劑的膠體金—羊抗兔IgG結(jié)合物可先低速離心(20nm金膠粒用1 200r/min,5nm金膠粒用1 800r/min)20min,棄去凝聚的沉淀。然后將5nm膠體金結(jié)合物用6 000g,4℃離心1h;20nm~40nm膠體金結(jié)合物,14 000g,4℃離心1h。仔細吸出上清,沉淀物用含1%BSA的PB液(含0.02%NaN3),將沉淀重懸為原體積的1/10,4℃保存。如在結(jié)合物內(nèi)加50%甘油可貯存于-18℃保存一年以上。
為了得到顆粒均一的免疫金試劑,可將上述初步純化的結(jié)合物再進一步用10%~30%蔗糖或甘油進行密度梯度離心,分帶收集不同梯度的膠體金與蛋白的結(jié)合物。
(2)凝膠過濾法:此法只適用于以BSA作穩(wěn)定劑的膠體金蛋白結(jié)合物的純化。將膠體金蛋白結(jié)合物裝入透析袋,在硅膠中脫水濃縮至原體積的1/5~1/10。再經(jīng)1 500r/min離心20min。取上清加至Sephacryl S-400(丙烯葡聚糖凝膠S-400)層析柱分別純化。層析柱為0.8 cm×20cm,加樣量為床體積的1/10,以0.02Mol/L PBS液洗脫(內(nèi)含0.1%BSA,0.05%NaN3,pH8.2者用IgG標(biāo)記物),流速為8ml/h。按紅色深淺分管收集洗脫液。一般先濾出的液體為微黃色,有時略混濁,內(nèi)含大顆粒聚合物等雜質(zhì)。繼之為純化的膠體金蛋白結(jié)合物,隨濃度的增加而紅色逐漸加深,清亮透明,zui后洗脫出略帶黃色的為標(biāo)記的蛋白組分。將純化的膠體金蛋白結(jié)合物過濾除菌、分裝,4℃保存。zui終可得到70%~80%的產(chǎn)量。
6.膠體金蛋白結(jié)合物的質(zhì)量鑒定
(1)膠體金顆粒平均直徑的測量:用支持膜的鎳網(wǎng)(銅網(wǎng)也可)蘸取金標(biāo)蛋白試劑,自然干燥后直接在透射電鏡下觀察。或用醋酸鈾復(fù)染后觀察。計算100個金顆粒的平均直徑。
(2)膠體金溶液的OD520nm值測定:膠體金顆粒在波長510nm~550nm之間出現(xiàn)zui大吸收值峰。用0.02Mol/L pH8.2 PBS液(含1%BSA,0.02%NaN3)將膠體金蛋白試劑作1︰20稀釋,OD520=0.25左右。一般應(yīng)用液的OD520應(yīng)為0.2~0.4。
(3)金標(biāo)記蛋白的特異性與敏感性測定:采用微孔濾膜免疫金銀染色法(MF-IGSSA)。將可溶性抗原(或抗體)吸附于載體上(濾紙、硝酸纖維膜、微孔濾膜),用膠體金標(biāo)記的抗體(或抗原)以直接或間接染色法并經(jīng)銀顯影來檢測相應(yīng)的抗原或抗體,對金標(biāo)記蛋白的特異性和敏感性進行鑒定。
(四) 膠體金標(biāo)記技術(shù)在免疫學(xué)中的應(yīng)用
膠體金標(biāo)記技術(shù)由于標(biāo)記物的制備簡便,方法敏感、特異,不需要使用放射性同位素,或有潛在致癌物質(zhì)的酶顯色底物,也不要熒光顯微鏡,它的應(yīng)用范圍廣,除應(yīng)用于光鏡或電鏡的免疫組化法外,更廣泛地應(yīng)用于各種液相免疫測定和固相免疫分析以及流式細胞術(shù)等。
1.液相免疫測定:將膠體金與抗體結(jié)合,建立微量凝集試驗檢測相應(yīng)的抗原,如間接血凝一樣,用肉眼可直接觀察到凝集顆粒。利用免疫學(xué)反應(yīng)時金顆粒凝聚導(dǎo)致顏色減退的原理,建立均相溶膠顆粒免疫測定法(Sol particle immunoassay ,SPIA)已成功地應(yīng)用于PCG的檢測,直接應(yīng)用分光光度計進行定量分析。
2.金標(biāo)記流式細胞術(shù):膠體金可以明顯改變紅色激光的散射角,利用膠體金標(biāo)記的羊抗鼠Ig抗體應(yīng)用于流式細胞術(shù),分析不同類型細胞的表面抗原,結(jié)果膠體金標(biāo)記的細胞在波長632nm時,90度散射角可放大10倍以上,同時不影響細胞活性。而且與熒光素共同標(biāo)記,彼此互不干擾。
3.膠體金固相免疫測定法
(1)斑點免疫金銀染色法(Dot-IGS/IGSS)是將斑點ELISA與免疫膠體金結(jié)合起來的一種方法。將蛋白質(zhì)抗原直接點樣在硝酸纖維膜上,與特異性抗體反應(yīng)后,再滴加膠體金標(biāo)記的第二抗體,結(jié)果在抗原抗體反應(yīng)處發(fā)生金顆粒聚集,形成肉眼可見的紅色斑點,此稱為斑點免疫金染色法(Dot-IGS)。此反應(yīng)可通過銀顯影液增強,即斑點金銀染色法(Dot-IGS/IGSS)。
(2)斑點金免疫滲濾測定法(dot immuno-gold filtration assay,DIGFA)此法原理*同斑點免疫金染色法,只是在硝酸纖維膜下墊有吸水性強的墊料,即為滲濾裝置。在加抗原(抗體)后,迅速加抗體(抗原),再加金標(biāo)記第二抗體,由于有滲濾裝置,反應(yīng)很快,在數(shù)分鐘內(nèi)即可顯出顏色反應(yīng)。此方法已成功地應(yīng)用于人的免疫缺陷病病毒(HIV)的檢查和人血清中甲胎蛋白的檢測。